Résumé :
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Les dysferlinopathies sont des dystrophies musculaires autosomiques récessives incluant entre autres la myopathie des ceintures de type 2B (LGMD2B), la myopathie distale de Miyoshi (MM). Elles sont causées par des mutations du gène DYSF composé de 55 exons qui est exprimé principalement dans le muscle squelettique et cardiaque. La dysferline (2080 acides aminés, poids moléculaire 237 kDa) comporte 7 domaines C2, impliqués dans la liaison Ca2+ dépendante à des phospholipides et des protéines, et un domaine transmembranaire C-terminal. La dysferline est localisée au sarcolemme de la fibre musculaire squelettique adulte, où elle jouerait un rôle dans la maintenance du sarcolemme. En l'absence de dysferline, la fusion des vésicules nécessaires pour réparer les lésions induites par les extensions/contractions de la fibre ne pourrait pas se faire. Un de mes projets de thèse est de développer une approche thérapeutique basée sur l'observation de 2 cas cliniques : (i) nous avons pu mettre en évidence la présence et la localisation à la membrane d'une mini-dysferline (?2-40) chez une patiente présentant un phénotype atténué de MM. Nous avons montré après transfert AAV de cette mini-dysferline dans une souris dysferline-déficiente, que cette protéine conservait sa fonction de réparation du sarcolemme (collaboration avec l'équipe I. Richard) (ii) d'autre par l'équipe de M. Sinnreich a également identifié chez une patiente présentant un phénotype très atténué de dysferlinopathie, une dysferline délétée de l'exon 32. Ces deux preuves de principes basées sur l'observation de patients, nous a permis de développer une stratégie par saut d'exon dans les dysferlinopathies en collaboration avec l'équipe de L. Garcia. Dans un premier temps, l'exon qui nous a semblé le plus pertinent à cibler a été l'exon 32 au vu du phénotype au vu des données présentées par M.Sinnreich. De plus cet exon code seulement pour une partie du domaine C2D et 4% des patients possèdent des mutations dans cet exon (base UMD-DYSF). Après sélection par analyse bioinformatique des cibles à masquer pour induire le saut d'exon, j'ai transfecté ces oligonucléotides antisens (AON) sous la forme 2'O-Methyl dans des fibroblastes transdifférenciés en myoblastes de témoins et de patients. Après 48h, nous avons pu mettre en évidence la présence d'un transcrit délété de l'exon 32 (?32) et une restauration de la production de quasi-dysferline. Nous avons également montré que la présence de cette protéine permettait d'améliorer la réparation membranaire et la fusion des myoblastes. Dans le but d'utiliser une thérapie combinée (thérapie cellulaire avec des AC133 modifiée par des lentivirus exprimant ces AON), j'ai ensuite construit des vecteurs lentiviraux permettant le saut de l'exon 32. Là aussi un saut de l'exon 32 a été observé avec une efficacité de 50%. Au vue de ces résultats il semble très probable que de faire sauter l'exon 32 ne soit pas néfaste à la fonction de la dysferline. Une étude clinique de phase II vient de montrer un gain de fonction chez des patients atteints de myopathies de Duchenne après injection d'oligonucléotide antisens. Nous sommes donc entrain de construire un modèle animal afin de confirmer que les cibles sélectionnées conduisent bien à une amélioration phénotypique.
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