Résumé :
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Notre projet cherche à développer une nouvelle stratégie de thérapie génique pour les déficits immunitaires combinés sévères évitant une transduction ex vivo des cellules souche hématopoïétiques et en ciblant directement in situ les thymocytes. Une injection intrathymique d'un vecteur lentiviral dans le cadre de la déficience en ZAP-70 a montré la fonctionnalité de cette approche. Une reconstitution à long terme de ces souris avec des cellules T fonctionnelles en périphérie a déjà été reporté (Adjali, O., et al. JCI 2005). En vu d'un développement en recherche clinique une amélioration de la sécurité des vecteurs est recherchée. Dans ce but, plusieurs modifications on été planifiées : (a) remplacer le promoteur CD4 minimal par la totalité du promoteur CD4 humain à l'exception du silencer empêchant une expression dans les lymphocytes T CD8+, (b) ajouter dans notre vecteur des insulateurs brevetés pour réduire le risque oncogénique, (c) inclure un gène de suicide. Notre modèle de travail est un variant de déficits immunitaires combinés sévères, ZAP-70. La mutation de cette protéine, impliquée dans la transduction du signal après stimulation des lymphocytes T au niveau du TCR, est caractérisée par une absence de lymphocytes T CD8+ en périphérie et des lymphocytes T CD4+ en périphérie non fonctionnel. Dans le cadre de cette maladie, la stratégie adoptée est d'utiliser un promoteur spécifique des lymphocytes T. Pour cela un promoteur minimal CD4 a été développé au sein du laboratoire, il a prouvé sa fonctionnalité dans le cadre d'injection intra-thymique dans des souris ZAP 70-/- qui ont développé un système immunitaire fonctionnel en périphérie. Son expression est bien limitée aux lymphocytes T chez la souris mais une fuite dans les cellules B humaines est constatée. Notre première modification a été de remplacer ce promoteur minimal par la version plus longue 1.1 kb (Salmon, P., et al. 1993. PNAS) pour augmenter sa spécificité T. Cette modification n'a pas permis d'abolir la fuite d'expression dans les 293T. Nous avons alors ajouté les insulateurs brevetés dans notre vecteur et observé une grande spécificité avec quasiment pas d'expression dans les 293T et une bonne expression dans les lignées T. Ces observations doivent être confirmées par des tests d'expression dans des lignées cellulaires non T, des cellules souches souris, humaines et des Mononucléaire Circulants Périphériques. Ces tests sont des préliminaires a une étude poussée sur l'efficacité et la sureté de l'injection intrathimique de notre vecteur dans des souris ZAP-70 -/-.
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