Résumé :
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Une meilleure connaissance des déterminants viraux et cellulaires impliqués dans la régulation de l'expression lentivirale est essentielle pour (i) maitriser l'expression d'un transgène dans le cadre d'un transfert de gène et (ii) mieux comprendre l'absence/la perte de l'expression du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) observé en cas de latence virale après infection. Dans ce contexte, les facteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance et la réparation des cassures de l'ADN, activés dès les étapes précoces du cycle viral, pourraient participer au contrôle de l'expression rétrovirale. Dans la première partie de cette étude, nous avons généré une collection de vecteurs lentiviraux codant le transgène green fluorescent protein (gfp) avec des design variés : promoteur du VIH-1 [long terminal repeat (LTRs)] ou d'origine hétérologue [e.g., promoteur viral CMV (cytomegalovirus), ou humain PGK (phosphoglycerate kinase)], intégrase native ou mutée, LTRs natifs ou self inactivating (SIN). En particulier, nous avons caractérisé l'impact de l'insertion de différentes séquences hétérologues au sein des SIN-LTRs sur l'expression du transgène gfp au cours du temps dans un contexte compétent ou déficient pour l'intégration. Nous avons mis en évidence un phénomène de modulation du niveau d'expression du transgène (d'un facteur 0,3 à 1,8 ; comparé aux vecteurs sans insertion) qui est dépendant de la séquence insérée et de son orientation. L'expression transgénique résulterait donc d'une balance coûts/bénéfices associés à l'insertion d'éléments aux extrémités des vecteurs qui pourrait déterminer le niveau d'expression du transgène à partir de vecteurs modifiés. Dans la seconde partie, nous avons réalisé une analyse systématique et comparative de l'expression lentivirale au sein des cellules humaines de carcinome de côlon HCT 116 déplétées pour le complexe Ku. Ce complexe, qui est essentiel à la survie chez l'homme et est impliqué dans les processus de réparation de l'ADN, a été identifié comme une cible anti-VIH potentielle. Nous avons mis en évidence que la déplétion en Ku induit une diminution de l'expression précoce du VIH-1 de façon spécifique du LTR et indépendante de Tat. Même si l'action de Ku nécessite l'intégration du VIH-1, sa déplétion ne modifie pas l'efficacité d'intégration virale mais agit plutôt au niveau transcriptionnel. Da façon importante, la réactivation de l'expression du transgène après traitement par l'activateur de NF-kappaB (Nuclear Factor kappaB), le TNFalpha (tumor necrosis factor alpha) ou un inhibiteur des déacétylases d'histones, la trichostatine A est favorisée par la déplétion en Ku. A l'inverse, en présence d'un niveau normal en Ku, les cellules exprimant le VIH-1 seraient contre-sélectionnées dans le temps. Ainsi, la déplétion en Ku pourrait promouvoir l'établissement d'un état (réactivable) de latence transcriptionelle associé à une moindre contre-sélection des cellules transduites. Les résultats issus de ce travail de thèse démontrent que l'expression lentivirale varie en fonction de nombreux paramètres, dont (i) le design des vecteurs, (ii) le type cellulaire transduit et son fond génétique, et (iii) le temps écoulé depuis la transduction, reflétant ainsi des interactions différentielles entre le vecteur et son hôte.
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