Résumé :
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La Dysferline est une protéine transmembranaire présente au niveau des cellules musculaire. Elle est impliquée dans plusieurs processus moléculaire encore mal définis, mais son rôle a été démontré dans le mécanisme de réparation membranaire. Des défauts dans le fonctionnement de cette protéine conduisent à deux phénotypes : la dystrophie musculaire des ceintures de type 2B et la myopathie distale de Miyoshi. Les perspectives d'approches thérapeutiques sont compliquées par la taille de l'ADN codant de la dysferline qui dépasse les capacités des vecteurs actuellement utilisés pour le transfert de gène dans le muscle. Nous avons utilisé une stratégie alternative basée sur la reprogrammation de l'ARN via un épissage en trans. Cet évènement est réalisé entre l'ARN pré-messager muté et une molécule exogène thérapeutique appelée pre-mRNA trans-splicing molecule (PTM). Le PTM agit en bloquant l'épissage endogène et en réorientant le complexe d'épissage sur lui-même, permettant le remplacement du ou des exons mutés par la séquence normale. Cette stratégie est applicable à tous types de mutation, à l'exception des très larges délétions. Une partie du projet consiste en l'obtention d'une preuve de principe du trans-épissage sur des cellules humaines de patients. Dans ce but, nous avons tout d'abord construit plusieurs PTMs composé d'un domaine de reconnaissance de l'intron 48 de la Dysferline, d'une partie de son cDNA et d'un épitope FLAG. Nous avons également construit un minigène couvrant les exons 47 à 55 de la dysferline qui servira de cible au trans-épissage. Après co-transfection de ces constructions dans des cellules HER911, nous avons validé l'expression du minigène et du PTM par RT-PCR. En utilisant des amorces spécifiques de la molécule trans-épissée attendue, nous avons pu observer sur gel d'agarose une bande à la taille attendue, démontrant que l'évènement de trans-épissage avait bien eu lieu. Un Western Blot a ensuite été réalisé en utilisant un anticorps anti-FLAG pour spécifiquement détecter la protéine trans-épissée. Une bande à la taille attendue a été détectée, démontrant que l'ARN trans-épissé a bien été traduit. D'autre bandes ont également été observé et laissent présager un possible trans-épissage sur l'ARN endogène de la Dysferline exprimé par les cellules HER911. Les résultats obtenus montrent une bonne efficacité du trans-épissage sur la Dysferline humaine, avec production de la protéine voulue. Suite à cette démonstration, cette stratégie va maintenant être appliquée sur des cellules myogéniques de patients.
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