Résumé :
|
Contexte général et intérêt du projet La possibilité de modifier de façon contrôlée le génome est essentielle dans tous les domaines de la biologie, autant pour la génomique fonctionnelle, la création d'organismes génétiquement modifiés d'intérêt expérimental, médical ou industriel, que dans des perspectives de thérapie génique. La recombinaison homologue le permet, mais son efficacité est le plus souvent insuffisante. Toutefois, elle peut être considérablement augmentée par une coupure double-brin. Grâce à l'élaboration de nucléases à doigts de zinc spécifiques de séquences, la société Sangamo a ainsi pu obtenir des taux de mutation dirigée de 1-10%. La société Cellectis développe aussi ce type de nucléases ; elle exploite l'existence de " homing nucléases " naturelles qui possèdent des sites de reconnaissance jusqu'à 30 paires de bases pour identifier des formes mutantes qui reconnaîtraient un répertoire de séquences plus varié. Dans les deux cas, pour une séquence d'intérêt donnée, l'élaboration de ce type de nucléases est en principe possible mais reste en pratique le facteur limitant. L'utilisation de nucléases synthétiques est une alternative aux approches précédentes et ce type de molécules peut être exploiter pour étudier certains aspects de la réparation et pour mettre en œuvre des approches originales de mutagenèse dirigée. Objectifs du projet L'objectif de mon travail de thèse est de développer des nucléases synthétiques spécifiques de séquence et de les utiliser pour des approches originales de mutagenèse dirigée. Pour créer de nouvelles nucléases capables d'induire des coupures ciblées du génome, nous avons choisi de coupler des ligands de l'ADN spécifiques de séquence à des agents capables de couper l'ADN. Comme ligands de l'ADN, nous avons commencé par utiliser des oligonucléotides formant des triple-hélices (TFO) et des polyamides. Les propriétés de ces différents ligands de l'ADN sont de mieux en mieux maîtrisées et permettent d'envisager de cibler un large répertoire de séquences d'ADN. Comme agent de coupure, nous avons débuté avec l'orthophénanthroline (OP) et mes résultats actuels montrent qu'avec les conjugués OP-TFO, il est possible d'obtenir des taux de mutation comparable aux taux obtenus avec une coupure par l'endonucléase naturelle I-Sce1 sur un gène rapporteur eGFP. L'objectif de ma 4ème année de thèse est de valider la généralisation de mes résultats, en particulier en ciblant des gènes endogènes pour la correction génique dans des maladies humaines.
|