Titre : | Etude fonctionnelle de l'acétylcholinestérase : régulation de la catalyse par la région de la porte arrière et recherche d'un partenaire non-catalytique endogène : Mise en évidence et caractérisation d'une nouvelle cible de la fasciculine, distincte de l'acétylcholinestérase |
Auteurs : | Mondielli G, Auteur |
Type de document : | Thèse/Mémoire |
Année de publication : | 2011 |
Pages : | 160 p |
Langues: | Français |
Mots-clés : | acétylcholinestérase ; biochimie ; catalase ; chat modèle ; chromatographie ; contraction musculaire ; ELISA ; fascicline ; gène ACHE ; hydrolase ; immunoglobuline G ; interaction protéine-protéine ; isolement et purification ; jonction neuromusculaire ; Poissons ; porte ; protéine recombinante ; rat ; récepteur cholinergique ; schéma ; Western blot |
Résumé : |
L’AChE hydrolyse le neurotransmetteur acétylcholine (ACh) dans les synapses cholinergiques des systèmes nerveux central et périphériques, afin de restaurer l’excitabilité de la membrane postsynaptique neuronale ou musculaire. Cette fonction est portée par le site catalytique qui est enfoui au coeur de la molécule d’AChE au fond d’une gorge longue, tortueuse et étroite. Actuellement cette gorge est la seule voie identifiée avec certitude pour l’entrée du substrat ACh vers le site actif et la sortie en sens inverse des produits de la réaction. L’apparente incompatibilité de cette géométrie avec la très grande activité spécifique de l’AChE a suggéré l’existence d’une « porte arrière », distincte de l’entrée de la gorge menant au site catalytique, et permettant une sortie rapide des produits de la réaction et/ou une entrée alternative d’ACh. L’objectif de ce projet était de démontrer l’existence de la porte arrière, la localiser exactement et en détailler le mécanisme d’action.
Notre modèle d’étude est l’AChE de gymnote (EeAChE), qui s’associe en tétramères similaires à ceux présents dans le cerveau et le muscle des mammifères, et a été choisie pour trois raisons : 1) des résultats structuraux préliminaires obtenus dans l’équipe pointent sur certains résidus d’EeAChE comme appartenant à la porte arrière ; 2) la sous-unité d’EeAChE présente l’activité catalytique la plus élevée parmi les AChEs, suggérant une porte arrière particulièrement efficace ; 3) nous disposons d’outils moléculaires spécifiques de cette AChE, sous la forme d’anticorps monoclonaux inhibiteurs, liant soit le site anionique périphérique à l’entrée de la gorge catalytique soit la région de la porte arrière. Nous avons conçu, généré, purifié, analysé et validé une EeAChE recombinante monomérique de type sauvage, puis nous avons conçu 7 mutants pour les résidus suspectés appartenir à la porte arrière. Les analyses biochimiques (de masse, homogénéité, oligomérisation, glycosylation, stabilité thermique), pharmacologiques (fixation et sensibilité aux anticorps inhibiteurs) et enzymologiques (paramètres catalytiques) démontrent l’existence d’une porte arrière dans l’AChE et contribuent à documenter un mécanisme original de régulation de l’activité enzymatique. Nos résultats pourraient aussi permettre le développement d’une nouvelle génération d’inhibiteurs plus sélectifs de l’AChE que ceux actuellement utilisés en thérapie humaine. |
Type de thèse : | Thèse |